Dieta scăzută cu carbohidrați pe termen lung duce la manifestări metabolice dăunătoare la șoarecii diabetici

Afiliere Departamentul III de Medicină Internă, Divizia de Diabet, Endocrinologie și Metabolism, Școala de Medicină a Universității Kyorin, Mitaka, Tokyo, Japonia

Departamentul de Afiliere pentru Anatomie, Facultatea de Medicină a Universității Kyorin, Mitaka, Tokyo, Japonia

Departamentul de Medicină pentru Afiliere, Universitatea de Științe Medicale Shiga, Otsu, Shiga Japonia

Divizia de afiliere a biologiei moleculare, Institutul pentru Cercetarea Genomului, Universitatea din Tokushima, Kuramoto, Tokushima, Japonia

Afiliere Departamentul III de Medicină Internă, Divizia de Diabet, Endocrinologie și Metabolism, Școala de Medicină a Universității Kyorin, Mitaka, Tokyo, Japonia

Departamentul de Afiliere pentru Anatomie, Facultatea de Medicină a Universității Kyorin, Mitaka, Tokyo, Japonia

Divizia de Afiliere a Biologiei Moleculare, Institutul pentru Cercetarea Genomului, Universitatea din Tokushima, Kuramoto, Tokushima, Japonia

Afiliere Departamentul III de Medicină Internă, Divizia de Diabet, Endocrinologie și Metabolism, Școala de Medicină a Universității Kyorin, Mitaka, Tokyo, Japonia

Keiko Handa,
Kouichi Inukai,
Hirohisa Onuma,
Akihiko Kudo,
Fumiyuki Nakagawa,
Kazue Tsugawa,
Atsuko Kitahara,
Rie Moriya,
Kazuto Takahashi,
Yoshikazu Sumitani

Corecţie

16 mai 2016: Handa K, Inukai K, Onuma H, Kudo A, Nakagawa F și colab. (2016) Corecție: Dieta scăzută pe termen lung cu carbohidrați duce la manifestări metabolice dăunătoare la șoarecii diabetici. PLOS ONE 11 (5): e0155751. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0155751 Vizualizați corecția

Cifre

Abstract

Citare: Handa K, Inukai K, Onuma H, Kudo A, Nakagawa F, Tsugawa K și colab. (2014) Dieta scăzută pe termen lung cu carbohidrați duce la manifestări metabolice dăunătoare la șoarecii diabetici. PLoS ONE 9 (8): e104948. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0104948

Editor: Julie A. Chowen, Hosptial Infantil Universitario Niño Jesús, CIBEROBN, Spania

Primit: 25 martie 2014; Admis: 14 iulie 2014; Publicat: 29 august 2014

Disponibilitatea datelor: Autorii confirmă că toate datele care stau la baza constatărilor sunt pe deplin disponibile fără restricții. Toate datele relevante se găsesc în lucrare.

Finanțarea: Acest studiu a fost susținut de Grant-in-Aid for Research Scientific nr. 25350898 (către KI) de la Ministerul Educației, Culturii, Sportului, Științei și Tehnologiei din Japonia. URL: http://www.jsps.go.jp/j-grantsinaid/. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii nu au conflicte de interese relevante pentru acest articol de declarat.

Introducere

În ultimul deceniu, identificarea intervențiilor dietetice adecvate a fost o sursă de controverse. Dietele cu conținut scăzut de carbohidrați au fost în centrul unui interes considerabil. Efectele terapeutice ale dietelor cu conținut scăzut de carbohidrați au fost investigate pe larg în mai multe stări clinice, inclusiv obezitatea, tulburările metabolice, evenimentele cardiovasculare și mortalitatea [1], [2], [3], [4], [5], [6], [ 7]. În studiile pe termen scurt de până la un an [1], [2], [3], pacienții obezi care consumă o dietă mediteraneană sau alta cu conținut scăzut de carbohidrați au prezentat condiții mai favorabile în ceea ce privește obezitatea, dislipidemia și controlul glicemic. Cu toate acestea, concluziile trase au fost limitate de proiectarea studiului, adică un număr mic, perioade scurte și respectarea slabă a dietelor speciale. Siguranța și eficacitatea pe termen lung a unei diete cu conținut scăzut de carbohidrați pentru gestionarea riscului bolilor cardiovasculare nu a fost încă determinată.

Recent, într-un studiu prospectiv de cohortă [4], s-a demonstrat că dietele cu conținut scăzut de carbohidrați și proteine ridicate sunt asociate cu un risc crescut de boli cardiovasculare. Mai mult, s-a raportat că o dietă cu restricție de carbohidrați crește mortalitatea [5]. Astfel, din punct de vedere clinic, în ultimii ani s-au stabilit efecte dăunătoare ale dietelor cu conținut scăzut de carbohidrați. Cu toate acestea, mecanismul științific prin care o dietă săracă în carbohidrați exercită un efect negativ asupra sănătății vasculare rămâne neadresat.

Până în prezent, majoritatea studiilor pe rozătoare s-au concentrat pe o dietă extrem de scăzută în carbohidrați, bogată în grăsimi (HFD), așa-numita dietă ketogenică (KD) [8], [9], [10], [11]. Acești șoareci au prezentat pierderea în greutate, probabil din cauza consumului scăzut de alimente [8], [9]. De fapt, o reducere a carbohidraților din dietă este însoțită de o creștere a grăsimilor și a proteinelor din dietă. Cu toate acestea, ar fi imposibil ca pacienții să continue să consume un KD pentru o perioadă prelungită. Din punct de vedere practic, o dietă săracă în carbohidrați, cu o compoziție moderată de grăsimi, ar trebui investigată în modelele de rozătoare.

Materiale si metode

Declarație de etică

Tot protocolul animalelor a fost efectuat conform Ghidului pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator din Universitatea Kyorin. Protocolul a fost aprobat de Comitetul pentru etica experimentelor pe animale de la Universitatea Kyorin (număr aprobat: 2014-152).

Animale

Test de toleranță intraperitoneală la glucoză și teste de toleranță la insulină

Pentru testele de toleranță la glucoză, șoarecii au fost posti timp de 8 ore și 10% soluție de glucoză a fost administrată intraperitoneal (2 mg/g corp pentru șoareci de tip sălbatic, 1,5 mg/g · corp pentru șoareci diabetici) așa cum s-a descris anterior [13]. Măsurătorile de glucoză au fost efectuate înainte de injectare și la 30, 60 și 120 de minute după injectare. Pentru testele de toleranță la insulină, șoarecii din stările postprandiale au fost injectați intraperitoneal cu 1,0 U/kg · insulină umană corporală (Eli Lilly, Indianapolis, IN, SUA). Măsurătorile de glucoză au fost efectuate înainte de injectare și la 30, 60 și 90 de minute după injectare. Nivelurile de glucoză plasmatică au fost măsurate cu ajutorul unui analizor de glucoză (Sanwa Kagaku Kenkyusho, Co., Nagoya, Japonia).

Măsurători ale markerilor biomedici

Înainte de sacrificiu, animalele erau postite timp de 8 ore. Probele de sânge au fost colectate prin puncție cardiacă folosind seringi heparinizate și centrifugate la 12.000 rpm timp de 5 minute. Analizele lipidice serice au fost efectuate la Centrul de Analize Skylight-Biotech (Akita, Japonia). Concentrațiile hormonale au fost măsurate folosind metode disponibile în comerț, adică, insulina imunoreactivă (IRI) a fost măsurată prin radioimunoanaliză (Morinaga Institute of Biological Science, Inc., Yokohama, Japonia) și factorul de creștere a fibroblastelor serice 21 (FGF21) de Quantikine ELISA Mouse/Rat FGF-21 (R&D Systems, Minneapolis, MN, SUA). Trigliceridele hepatice (TG) au fost extrase prin metodele Bligh și Dyer [14] și analizate folosind un reactiv disponibil comercial pentru TG (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japonia). Urina a fost analizată pentru cetone, creatinină și albumină folosind o tehnică standard de laborator.

Analiza acizilor grași utilizând HPLC

Analiza cantitativă a ARNm hepatic și proteine

Imunohistochimie pentru markeri de stres oxidativ hepatic (4-HNE și 8-OHG)

analize statistice

Datele sunt prezentate ca mijloace ± SE. Transformarea jurnalului variabilelor continue a fost utilizată atunci când a fost necesar pentru a satisface cerințele de distribuție pentru testele parametrice. Comparații între două grupuri au fost făcute cu testul t Student. Pentru comparații între trei grupuri, ANOVA unidirecțional a fost utilizat cu testul Tukey. Valoarea P Figura 1. Modificări ale greutății corporale, greutate hepatică, greutate grasă epididimală și conținut de TG hepatic în fiecare grup (n = 6).

(A) Șoarecii de tip sălbatic (panoul din stânga), STZ (panoul din mijloc) și KKAy (panoul din dreapta) au fost hrăniți în perechi cu un chow standard (dietă SC, linii solide), un conținut scăzut de carbohidrați (dieta LC, linii punctate) sau un dietă cu restricție de carbohidrați (dietă SR, linii punctate) timp de 16 săptămâni. Greutatea ficatului (B), greutatea epididimului (C) și conținutul hepatic de TG (D) au fost analizate în fiecare grup la sfârșitul studiului (linia 1: WSC, linia 2: WLC, linia 3: WSR, linia 4: SSC, linia 5: SLC, linia 6: SSR, linia 7: KSC, linia 8: KLC, linia 9: KSR). * p Tabelul 2. Parametrii biochimici ai fiecărui grup.

Într-un test de toleranță la glucoză intraperitoneală, WSR și KSR au prezentat intoleranță marcată la glucoză în comparație cu șoarecii WSC și respectiv KSC (Fig. 2A, 2B). La șoarecii STZ, nu au existat diferențe semnificative între cele trei diete, sugerând că deteriorarea toleranței la glucoză din cauza deficitului de insulină este atât de izbitoare încât efectele dietetice asupra intoleranței la glucoză ar putea fi neglijabile. În testul de toleranță la insulină (Fig. 2C, 2D), sensibilitatea la insulină a scăzut la șoarecii hrăniți cu dieta SR comparativ cu cei cărora li s-a administrat dieta SC și această reducere a fost dependentă de cantitatea de carbohidrați din dietă. Aceste rezultate sugerează că o dietă scăzută în carbohidrați exercită efecte dăunătoare asupra sensibilității la insulină atât la șoarecii diabetici, cât și la cei fără diabet.

(A) Șoarecii hrăniți cu dieta SC (linii solide), dieta LC (linii punctate) și dieta SR (linii punctate) au fost postite timp de 8 ore și soluția de glucoză a fost administrată intraperitoneal (2 mg/g corp pentru șoareci de tip sălbatic, 1,5 mg/g · corp pentru șoareci diabetici). (B) Zona de sub curbă (ASC) a fost calculată pentru a măsura gradul de afectare a toleranței la glucoză. (C) Șoarecii din stările postprandiale au fost injectați intraperitoneal cu 1,0 U/kg · insulină umană din corp. (D) ASC a fost calculată pentru a măsura gradul de afectare a toleranței la insulină. * p Figura 3. Depistarea cauzei intoleranței la glucoză prin examinarea nivelurilor transcripționale hepatice ale diferitelor gene în șoareci de tip sălbatic, STZ și KKAy hrănite cu dieta SC sau SR.

Expresiile ARNm hepatice ale fiecăreia dintre genele la șoareci de tip sălbatic (A), STZ (B) și KKAy (C) hrăniți cu dietă SC sau SR au fost evaluate prin RT-PCR și prezentate pe măsură ce creșterea ori în comparație cu șoarecii hrăniți cu SR dietă. * p Figura 4. Expresia ARNm hepatic și nivelurile serice ale FGF21.

Nivelurile de ARNm FGF21 ale șoarecilor de tip sălbatic (A), STZ (B) și KKAy (C) au fost analizate prin PCR cantitativă în timp real. Nivelurile serice FGF21 (D) au fost măsurate folosind un kit ELISA (linia 1: WSC, linia 2: WLC, linia 3: WSR, linia 4: SSC, linia 5: SLC, linia 6: SSR, linia 7: KSC, linia 8: KLC, linia 9: șoareci KSR). * p Figura 5. nivelurile de mARN și proteine ale PGC1α în WAT.

(A) Nivelurile de ARNm PGC1α de șoareci de tip sălbatic și KKAy au fost analizate prin RT-PCR. * p Figura 6. Nivel mRNA și proteine hepatice SCD1 de șoareci de tip sălbatic, STZ și KKAy.

Rapoartele C16: 1/C16: 0, C18: 1/C18: 0 (A) și C18: 0/C16: 0 (B) au fost calculate, pe baza datelor obținute din analiza serică a acizilor grași (linia 1: WSC, linia 2: WLC, linia 3: WSR, linia 4: KSC, linia 5: KLC, linia 6: KSR). Nivelurile de ARNm SCD1 (C) și Elovl6 (D) ale tuturor modelelor murine au fost analizate prin PCR cantitativă în timp real (bara albă: șoarecii au alimentat dieta SC, bara gri: șoarecii au hrănit dieta LC, bara neagră: șoarecii au hrănit dieta SR) . Nivelurile de proteine hepatice SCD1 de șoareci de tip sălbatic (E), STZ (F) și KKAy (G) au fost analizate prin Western Blot. În panourile din mijloc, sunt prezentate date reprezentative (două eșantioane pentru fiecare grup). În panourile inferioare, fiecare coloană arată media ± S.E. obținut de la 6 șoareci (bară albă: șoareci hrăniți cu dieta SC, bară gri: șoareci au hrănit dieta LC, bara neagră: șoareci au hrănit dieta SR) Panourile superioare arată controlul intern utilizând anticorp anti-actină β. * p Figura 7. Imunohistochimie pentru 4-HNE și 8-OHG.

Trei câmpuri optice de secțiuni de la fiecare animal (n = 3) au fost alese aleatoriu și fotomicrografiate. Mărirea originală este × 50. Intensitatea colorării a fost cuantificată utilizând imaginea J. Imaginile color au fost supuse mai întâi deconvoluției culorii folosind pluginul lui G. Landini pentru a obține imagini separate de DAB și hematoxilină la scară de gri. Am măsurat densitatea optică medie a colorării DAB în citoplasmă pentru 4-HNE (A) și cea din zona nucleelor pentru 8-OHG (B), aplicând imagini cu mască binară a nucleelor create din imagini de hematoxilină și am evaluat intensitatea colorării . Panourile superioare sunt controale negative, lipsite de anticorp primar. O imagine reprezentativă a șoarecilor de tip sălbatic (panouri medii) și KKAy (panouri inferioare), hrănite cu dieta SC (panourile din stânga: fără colorare hematoxilină, panourile din mijloc: cu colorare hematoxilină) și dieta SR (panourile din dreapta: cu colorare hematoxilină) este prezentat. Graficele cu bare din dreapta arată medii ale intensității colorării. * p Tabelul 3. Compoziția acizilor grași din fiecare grupă (mg/ml).

Discuţie

Deoarece scopul acestui studiu a fost pur și simplu de a investiga efectele diferiților macronutrienți asupra fenotipurilor biologice la șoareci de tip sălbatic și diabetici, nu am putut pregăti șoareci de control corespunzători, adică șoareci STZ versus șoareci injectați cu PBS sau șoareci KKAy versus KK. Astfel, observațiile noastre nu ne permit să tragem concluzii cu privire la diferențele dintre modelele animale. Într-un experiment preliminar, am pregătit șoareci STZ printr-o metodă convențională [24]. Cu toate acestea, șoarecii STZ hrăniți cu dieta SR (șoareci SSR) nu au supraviețuit mai mult de o săptămână după injectare, ceea ce ar putea fi atribuit cetoacidozei severe. Astfel, am schimbat protocolul și am injectat o cantitate mai mică de STZ așa cum se menționează în metode. Cu această modificare, șoarecii STZ utilizați în studiul nostru au prezentat o creștere mai mică a glucozei plasmatice și niveluri mai ridicate de insulină de post decât șoarecii STZ descriși anterior [24], indicând faptul că acești șoareci nu seamănă cu modelele de diabet de tip 1, seamănă în schimb cu modelele de diabet de tip 2 cu epuizarea celulelor β.

Una dintre limitările studiului nostru este că nu putem exclude posibilitatea ca observațiile noastre să fi fost afectate de dietele bogate în proteine furnizate, deoarece proporțiile de proteine și carbohidrați sunt invers proporționale. Într-un studiu foarte recent al rozătoarelor, sa constatat că raportul carbohidrați/proteine, nu aportul de calorii, determină sănătatea cardiometabolică, îmbătrânirea și longevitatea la șoareci [39]. Deși descoperirile noastre nu ne permit să identificăm ce macronutrienți, adică un conținut scăzut de carbohidrați sau un conținut ridicat de proteine, dăunează sănătății, este de remarcat faptul că descoperirile noastre aruncă lumină asupra fenotipurilor cardiometabolice afectate de raportul carbojidrat/proteină.

Am investigat efectele pe termen lung ale unei diete cu conținut scăzut de carbohidrați asupra modelelor diabetice murine. Acești șoareci, atunci când au fost hrăniți cu o dietă scăzută în carbohidrați, au prezentat intoleranță la glucoză, au scăzut nivelurile serice de FGF21 și, de asemenea, au scăzut expresia SCD1 hepatică. Toate aceste reduceri au fost dependente de cantitatea de carbohidrați din dietă. În special, aceste manifestări nu au legătură cu reglarea greutății la șoarecii diabetici. Din câte știm, acesta este primul raport care indică faptul că o dietă scăzută în carbohidrați duce la manifestări metabolice dăunătoare la șoarecii diabetici, ceea ce poate explica legătura strânsă dintre astfel de diete și riscurile ridicate de evenimente cardiovasculare și morbiditate observate în mediile clinice.

Mulțumiri

Mulțumim doamnei Tomoko Miura pentru sprijin tehnic cu experimentele de imunohistochimie.

Contribuțiile autorului

Conceput și proiectat experimentele: KI HK SO HI. Au efectuat experimentele: KH AK FN KT HO AK YS. Analiza datelor: RM TH. Contribuție la scrierea manuscrisului: KI KT.